siRNA
小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）有时称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。已知siRNA主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。不过这些复杂机制的反应途径尚未明了。
什么是RNA干扰
RNA干涉(RNAinterference，RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。
RNA干扰由转运到细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA（miRNA）诱导特定mRNA翻译的抑制。通过短反义核酸（siRNA和shRNA序列）锁定细胞mRNA，从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集，导致其水平的下降，最终实现抑制作用。
RNA干扰最初是怎样发现的呢？我们也简单回顾下：
早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达，但后来人们发现发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。
RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时所发现的，为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶，结果意外得到了白色和白紫杂色的矮牵牛花，并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低50倍。约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达。
1992年，罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达。
1995年，Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象。
1998年，安德鲁·法厄（Andrew Z. Fire）等在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果。从与靶mRNA的分子量比考虑，加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果，因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。并且将这种现象命名为RNA干扰。
RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。
RNAi 技术要点
1.siRNA 的设计
RNAi 技术要求siRNA 反义链与靶基因序列之间严格的碱基配对, 单个碱基错配就会大大降低沉默效应, 而且siRNA 还可以造成与其具同源性的其它基因沉默(也叫交叉沉默) , 所以在siRNA 的设计中序列问题是至关重要的。要求所设计的siRNA 只能与靶基因具高度同源性而尽可能少的与其他基因同源。
设计siRNA 序列应注意以下几点:
① 从靶基因转录本起始密码子AUG 开始, 向下游寻找AA 双核苷酸序列, 将此双核苷酸序列和其下游相邻19 个核苷酸作为siRNA 序列设计模板;
② 每个基因选择4～5 个siRNA 序列, 然后运用生物信息学方法进行同源性比较, 剔除与其他基因有同源性的序列, 选出一个特异性最强的siRNA;
③ 尽量不要以mRNA 的5'端和3'端非翻译区及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板, 因为这些区域有许多调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物) , 调节蛋白会与RISC 竞争结合靶序列, 降低siRNA 的基因沉默效应。
2.siRNA 的合成
目前获得siRNA 主要有体外制备和体内表达两种方式。
2.1.体外制备
2.1.1.化学合成
许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究
不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素
2.1.2.体外转录
以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。
2.1.3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗
在体外(in vit ro) 可用不同的方法将siRNA导入靶细胞, 一般来讲化学合成和体外转录合成的siRNA 可用电转移(elect roporation) 、微注射和转染的方法引入细胞。而表达质粒则常通过转染的方法导入靶细胞然后再表达siRNA。向体内(in vivo) 导入siRNA 的研究工作也已有报道, 如有研究者用静脉注射的方法将合成的siRNA 引入动物体内进行基因功能的研究。
2.2体内表达
前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。
2.2.1.siRNA表达载体
多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
2.2.2. siRNA表达框架
siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECS)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是
①PCR产物很难转染到细胞中
②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）
RNA干扰（RNAi）技术的应用
RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和简单性，所以是基因功能研究的重要工具。大多数药物属于标靶基因（或疾病基因）的抑制剂，因此RNAi 模拟了药物的作用，这种功能丢失（LOF)的研究方法比传统的功能获得（GOF)方法更具优势。因此, RNAi 在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具。同时，那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物。
在药物标靶发现和确认方面，RNAi技术已获得了广泛的应用。生物技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞，然后通过观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因。如可通过RNAi文库介导的肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因。一旦所发现的基因属于可用药的靶标（如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌出细胞外），就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选。此外，被发现的靶标还可用RNAi技术在细胞水平或动物体内进一步确认。
在疾病治疗方面，双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗，如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等。在抗病毒治疗方面，帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法。肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果。
单链Oligo合成与DNA组装技术
合成生物学作为迅速发展的交叉学科，已在生物医药、新材料、诊断、能源和数据储存等领域展现越来越广泛的应用潜力。合成基因组学作为合成生物学的重要研究方向，着重于新生命体系的从头设计与合成，其以Oligo（寡核苷酸链）合成、拼装和转移等核心技术为支撑。新生命体系的从头设计与合成不仅需要合成组成基因组的小片段DNA片段，还需要通过后续的组装与拼接获取完整的合成基因组。Oligo合成及基因组DNA拼装、转移技术是合成基因组学乃至整个合成生物学领域的核心技术体系，今天主要来介绍体外单链DNA（Oligo）合成与双链DNA拼接组装技术。
1. 单链Oligo合成技术
Oligo即寡核苷酸链，分子实验室常用的PCR引物、NGS捕获探针、qPCR探针和FISH探针等都是Oligo。与双链DNA相比，Oligo有个一个共同的特点他们都是单链DNA序列，根据功能不同，可以在Oligo上修饰荧光基团、化学基团（如，羧基、氨基、巯基等，）等。根据合成原理，目前Oligo的合成方法可分为已经成熟并商业化的化学合成法和正在研发中的酶促合成法。
1.1 化学法
Oligo的化学合成研究始于20世纪50年代，Michelson和Todd首次报道采用磷酸二酯法实现了寡聚二核苷酸的合成。到20世纪80年代，Beaucage和 Caruthers开发了基于亚磷酰胺的DNA合成方，即今天Oligo自动化生产所采用的主要方法。该方法包括去保护、偶联、加帽（可选）及氧化 4 个步骤 （图 1）。由于随着链延长所带来的化学反应效率、合成纯度以及产率的下降，目前该方法合成的Oligo长度一般不会超过200个核苷酸（nt）。为了提高通量，从20世 纪90年代开始发展起来的基于微阵列芯片的DNA合成策略，使得合成成本降低了若干个数量级。然而由于芯片特有的不均一性及边缘效应等原因，相较传统的柱法合成，芯片法合成在长度、准确性方面均有所下降。为了增加芯片合成的精确度，科学家采用不同的技术策略，从各异的芯片产物中挑选出正确合成的寡核苷酸原料。Kosuri采用了多重PCR策略，选择性扩增目的寡核苷酸片段，结合酶促纠错等方法，可以合成长度超过200 nt的寡核苷酸原料，实现了更大规模和更高精度的合成。
图 1.固相亚磷酰胺法从头合成寡聚核苷酸链的4步反应
4步反应包括：（1）去保护。酸催化去除 DMT（二甲氧基三苯基甲基）基团，以便下一轮碱基（dA、dC、dG和dT）添加。（2）碱基偶联。将含有DMT保护基团的亚磷酰胺通过四唑活化剂加到未保护的5′OH末端。（3）加帽。将游离的5′OH乙酰化，以防止进一步的链延伸所造成的单碱基缺失。（4）氧化。通过碘液将磷酸三酯氧化为磷酸盐，进入一个反应循环.
1.2 酶促从头合成法
目前亚磷酰胺法是商业化Oligo合成的主流方法，但其合成的长度限制在200nt左右，而且合成过程中亦会大量使用有毒化学试剂。由于在合成准确性及不需要使用毒性化合物等方面的潜在优势，酶促合成方法受到了越来越多的关注。与化学法相比，酶促法的作用条件温和，对DNA的损伤较少，有助于准确性的提高，同时减少了副产物的产生，可实现更长Oligo的合成。然而，酶促法的发展缓慢，至今未能实现商业化。根据Jensen和Davis对DNA酶促从头合成发展的总结，末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）介导的酶促合成法是较好的选择，但还需要更进一步优化。TdT介导的DNA合成技术开发中首先需要解决单个dNTP添加后的终止效率及末端重新活化的问题。近期，Palluk等提出了一种解决方案，他们将 dNTP通过可光诱导剪切的连接子与TdT连接，所得dNTP-TdT复合物可在10—20s的时间完成DNA链的延伸，而且可以重复进行，实现特定DNA链的合成。该方法将为具有实际应用价值的酶促DNA合成法的开发打下基础。
2. 双链DNA/基因合成技术
DNA合成技术是合成基因组学，乃至现代分子生物学的根基,受当前合成技术的限制，双链DNA/目标基因组只能以短链Oligo的形式逐步拼接才能获得。PCR（聚合酶链式反应）或者酶切方法只限于获得自然界已有的DNA片段，而双链DNA/基因组的从头合成则需要通过Oligo的拼接获得，所以，如何提高Oligo合成的长度和效率、降低合成成本是后续进行大规模基因组合成的关键突破点。体外双链DNA的拼接根据原理区别，分为以下几种技术。
2.1 Gibson 组装
Gibson组装最早由Gibson等在2009年提出，原理如图2所示。该技术基于5′核酸外切酶、DNA 聚合酶及连接酶，利用DNA片段的两端同源序列（其长度通常为15−40bp），实现DNA组装。将这些DNA片段和3种酶的混合溶液孵育1h即可。5’外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合；DNA聚合酶，用于修补由5’外切酶产生的缺口，在Gibson组装中用的是Phusion DNA聚合酶,当然，Taq DNA聚合酶也可以用；DNA连接酶，实现共价连接，形成完整的DNA分子。该方法的优势在于这3种酶都可以在同一个温度下发挥功能，可一步完成组装，组装后的质粒可直接用于转化感受态细胞，无需限制性内切酶，通常该方法可组装不超过6个片段。
2010 年，Gibson等科学家使用Gibson组装和酿酒酵母体内同源重组人工合成了1.08Mb的丝状支原体基因组并转入去核的山羊支原体，新移殖的细胞表现出了丝状支原体的性状。2016年，Hutchison 等人先用 PCR 合成一系列丝状支原体基因组片段，每个DNA片段长1.4 kb，然后每5个分成一组，再利用 Gibson 组装技术将5个一组的DNA片段连接成7 kb的单片段，最后组装成完整的基因组。作者只保留了必需基因，将1.08 Mb的基因组缩短到了含有473个基因的 531 kb。2017 年，Esvelt等人将Gibson组装技术与CRISPR/Cas9 技术结合构建了一个PAM质粒文库，用于评估鉴定来自不同物种的一系列不同的Cas9蛋白的活性。该方法在体外组装技术中应用广泛。
图2 基于5′核酸外切酶、DNA 聚合酶及连接酶的Gibson组装法
通过一步等温体外重组两个相邻的DNA片段(红色和蓝色，共用终端序列为黑色)，两个DNA片段共价连接成同一个DNA分子。T5外切酶去除双链DNA分子的5’端核苷酸，产生粘性末端，互补单链DNA退火结合在一起，Phusion DNA聚合酶填充缺口，Taq DNA连接酶密封缺口。T5外切酶是不耐热的，在50℃培养期间失活，所以不会与DNA聚合酶竞争DNA模板。
2.2 Golden Gate组装
Golden Gate组装技术是基于非同源重组的代表性技术，其利用Ⅱ型限制性酶 BsaⅠ在识别位点外部切割的特性，设计特异的突出序列同时组装多个片段，且酶切和酶连可以同时进行，原理如图3所示。首先，扩增目的片段，在两端加上BsaⅠ识别序列，同时在识别序列内侧加上不同的4 nt突出部分，相邻片段衎接处的4 nt反向互补配对，然后将片段分别插入酶切前的中间载体，因此一共可以设计256个突出的末端。利用E.coli富集含有不同目的片段的中间载体，将这些载体与最终的载体(含有2个相邻的BsaⅠ酶切位点)混合，加入BsaⅠ和DNA连接酶，同时进行酶切和酶连组装多达9个DNA片段。
2011年，Cermak等人利用Golden Gate高效组装了TALEN敲除系统中的重复序列，整个过程只需要两步：第一步先将最多10个RVDs按顺序组装，每个RVDs可识别1个核苷酸；第二步再将这些RVDs和TALEN系统的其它功能元件如NLS、AD等组装成最终的敲除质粒。2015年，Lauressergues等人使用Golden Gate构建microRNAs表达质粒，探究了苜蓿、拟南芥中2条 microRNAs的转录调控作用及其它5条microRNAs编码的具有调控作用的短肽对植物主根生长的影响。
图3 基于Bsa I内切酶的Golden Gate组装
图3 Golden Gate组装
2.3 同尾酶BioBrick、iBrick 和 C-Brick
BioBrick是合成生物学领域一个经典的基因组装技术，BioBrick的原理如图4所示。同尾酶可以识别不同的DNA序列但是能切出相同黏性末端的一类限制性内切酶，但其切开的末端相互连接后不会再形成原酶切位点。其利用同尾酶Xba Ⅰ和 Spe Ⅰ酶切产生相同的粘性末端，酶连后片段连接处会产生86p的疤痕，Xba Ⅰ和Spe Ⅰ都不再识别连接处的疤痕，这样即可在不损失酶切位点的情况下不断组装DNA片段。2014年，国内学者利用归位内切酶I-Sce Ⅰ和PI-Psp Ⅰ可产生相同粘性末端的特点，模仿BioBrick原理设计出一种名为iBrick的DNA 组装方法。归位内切酶识别的序列比普通的限制性内切酶长，在DNA中出现的频 率极低，因此iBrick相比于BioBrick对DNA片段序列几乎没有限制。但较长的识别序列在酶切酶连组装的同时也产生了更长的疤痕，为了解决这个问题，科学家利用一种应用了CRISPR-Cas系统的DNA组装方法C-Brick。C-Brick利用Ⅴ型CRISPR/Cas 系统蛋白Cpf1核酸内切酶，在PAM位点切割产生5nt的粘性末端。该方法利用sgRNA识别长序列的特点避免了对待组装片段序列的要求，同时可灵活设计sgRNA以识别不同的序列，只产生5 bp的疤痕，完美地规避了 BioBrick 的缺点。
图4 BioBrick技术的组装原理
2.4 基于DNA聚合酶的策略。
该方法首先合成有互补配对重叠区的Oligo，利用PCR扩增的原理，可以对有互补重叠区的Oligo进行延伸连接获得小DNA片段，然后小DNA片段以重叠PCR的方式进行逐步连接获得目的DNA片段，以其作为模板，进一步PCR扩增可以大量获得目的片段（图5）。此方法（polymerase cycling assembly，PCA）无须依赖额外的DNA连接酶，直接从人工合成的Oligo开始组装，操作简单、快速。Stemmer 等人曾用此法实现基因及质粒的一步拼装。Smith等人则 通过增加 Taq 连接酶的步骤用此法合成了 ФX174 噬菌体 的基因组。
图5 基于DNA聚合酶合成法
3. 其他DNA组装技术
除了以上最常用的基因组装技术外，近年来发展起来很多其他DNA组装方法，如：SLIC、UNS、 PaperClip和 MASTER等方法。
miRNA
miRNA是：微RNA（microRNAs，又译小分子RNA）是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的RNA分子，可调节其他基因的表达。miRNA来自一些从DNA转录而来，但无法进一步转译成蛋白质的RNA（属于非编码RNA）。miRNA通过与靶信使核糖核酸(mRNA)特异结合，从而抑制转录后基因表达， 在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。在动物中，一个微RNA通常可以调控数十个基因。
micrornas(mirnas )是在真核生物中发现的一种内源性调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是长的初级转录物经过一系列核酸酶剪切加工产生的，然后整合到RNA诱导的沉默性状中，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，通过互补程度的不同指导沉默性状降解靶mRNA，或靶向mRNA
miRNA存在于细胞核中，植物中编码细胞核内mirna的基因转录与加工是偶联的。 也就是说，mirna的形成过程在细胞核中完成，不存在mirna前体从细胞核转运到细胞质的过程。 miRNA是一种存在于动植物体内、大小为2L-25nt的内源性非编码单链小分子RNA，在机体转录后的基因表达调控中起重要作用。
miRNA的功能
miRNA的作用机制 1、RNA诱导沉默复合体（RISC）的形成 2、miRNA诱导的基因沉默模式及其相关机制
miRNA的功能
很多研究证明 miRNA是通过参与调节其下游基因翻译过程面发挥其生物学功能。比如，Lai等观察到果蝇miR-2a、miR-2b、miR-6、miR-11、miR-13a及miR-13b等的5'端6~8nt序列具有一定的关联性，它们均可与K框(Kbor)的相同序列互补K框是作为负调控果蝇增强子断裂( enhancer split)复合体基因的3'UTR序列中的保守基因序列。对于一些带有K、GY或Brd框的基因(GY和Brd框是类似于K框的其他基因3'UTR中的控制元件)，可以被 miRNA识别并与之碱基配对。其实，基于 MIRNA作用机制，可将其分成两个区域，其5'端的核苷酸代表了“姓”( family)区域，该区域匹配这些框中的一个，而其他的区域类似“名”( forename)，特异白匹配特定的靶，在动物中，单个mRNA可识别多个mRNA靶标，一个mRNA靶标可被多个 miRNA识别。根据 miRNA保守的5'端“种子”顺序同源性搜索分析，推测人类基因组中约三分之二的蛋白质编码基因受 miRNA的调控。已知所有动物 miRNA作用的mRNA靶点均在其3＇UTR。
miRNA的作用机制
miRNA对靶基因的作用机制一直是众多研究人员的关注热点。最早被发现的两个miRNA ——lin4和let-7被认为是通过不完全互补结合到基因mRNA 3' UTR，以一种未知的方式抑制蛋白质翻译，进而抑制蛋白质合成，阻断mRNA的翻译过程。后来的研究也发现，多个果蝇 miRNA和它们的基因mRNA的 3' UTR 存在部分同源。但由于 miRNA与其目标靶之间的互补是不完全的，用生物信息学的方法鉴定 miRNA的目标位点并非易事。在植物中，由于 miRNA与潜在的基因是完全互补的，使得植物的miRNA预测相对较容易。但这些预测基因是否就是 miRNA的靶基因，还需要作进一步验证。
研究表明， miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其与基因的作用模式不同，主要可分为以下3种类型：
①作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与 siRNA非常类似，最后切割mRNA，常见于植物。
②作用时与靶标基因不完全互补结合，进而阻止翻译而不影响mRNA的稳定性，这是目前发现最多的作用模式，常见于动物。(如下图)
（图一)
③具有以上两种作用模式，当与标基因完全互补结合时，直接向切割mRNA，当与标基因不完全互补结合时，阻止基因翻译。（如上图）miRNA对基因的调控，正如前文所述， Pre-miRNA由 exportin-5输出至胞浆中，然后释放 Pre-miRNA. Pre-miRNA与Dicer互补结合，产生长度为22nt的不完全配对的双链RNA。最后，双链中只有一条单链与RNA诱导的RISC结合，随后与把mRNA互补。而 miRNA*释放后则被降解。对于 miRNA来说，发挥对靶基因的调控作用， Dicer和RISC是必不可少的。因为 Dicer是产生 miRNA不可或缺的，而RISC则是 miRNA实现功能的载体。
1、RNA诱导沉默复合体（RISC）的形成
2001年， Elbashir等在《基因发育》杂志( Genes Devolopment)发表一篇文章，介绍了在果蝇体外系统中加入合成21~23nt的 siRNA，使之能有效降解同源mRNA他们发现当siRNA浓度增加到一定阈值时，mRNA降解程度不再继续增加，提示在果蝇裂解液中含有一定数量RNAi所需蛋白因子。这些RNAi所需蛋白因子是一种复合物，被定义为RNA诱导的沉默复合体(RISC）。研究发现，RISC是一种核糖核蛋白，主要由RNA和蛋白质成分组成。其中的RNA即是siRNA，而蛋白质成分主要为AGO22、VIG、dFXR以及Dmp68等，并且，这些蛋白质成分是组成RISC所必须的，并参与RNAi过程。
miRNA介导的RISC简称为 miRISC( miRNA-containing RNA induced silencing coplex)，也被称作 miRNA核糖核蛋白复合体( miRNP)。miRISC复合体除了包括成熟 miRNA外，还包含Dicer蛋白和多种其他相关蛋白。其与RISC结合的原理与siRNA类似，通过miRNA: miRNA*双体两端热力学稳定性的分析，可以分为两类结合：优势结合与等势结合。以 dsRNA为例，当双链中两根支链的稳定性相似或相同时，它们结合进入RISC的概率也相似或相同，因此称为等势结合（如图一所示）。当双链中支链的稳定性相对较弱时，解旋会从稳定性弱的一支解开dsRNA，从而会偏向性地产生一条结合到RISC复合体上，这类结合称为优势结合，未进入RISC的互补链RNA会很快降解(如图二所示)。
(图二）
RISC是 miRNA参与靶基因调控过程中不可或缺的载体。在 miRISC复合体中， Dicer对Pre-miRNA的处理与双链螺旋的解旋是偶联进行的。通常，只有一条链进入 miRISC，具体选择双链中哪一条链取决于碱基热动力学稳定性等因素。不进入RISC的 miRNA链被称之为伴随链( passenger)，并被冠以星号(*)，具有更低的稳定性，通常情况下被降解掉。但在某些情况下，两条链均具有活性，成为针对不同靶基因mRNA的功能 miRNA。RISC是具有多轮催化效应的酶。在这一过程中，其核心组分Ago2发挥重要作用。因此，在组成 miRISC的蛋白质中，Ago蛋白家族成员在RISC功能中处于中心地位，Ago蛋白家族在哺乳动物中有8种，分为Ago和PIWI两个亚家族。人Ago亚家族有四种: hagol-4；PIW亚家族有HIWI、HILI、 PIWIL3、HIWI2四种。果蝇有两种Ago蛋白，分别是Agol和Ago2。
(图三）
Ago家族蛋白为一类分子质量约为100kD的蛋白质，属于进化保守的家族，包含有PAZ和Piwi两个保守的RNA结合结构域，是目前唯一一种在所有RNAi和 miRNA通路中均可发现的蛋白。PAZ结构域负责结合引导链( guide) miRNA的3' 端突出的2个核苷酸或者单链RNA的3'-OH；PIWI结构域则负责组装核酶H( ribonuclease- H)，并与 miRNA 5＇端结合。Ago蛋白与 miRNA结合使其朝向正确，以便与靶基因mRNA作用。Ago蛋白可能招募其他蛋白行使翻译抑制功能;一些Ago蛋白直接切割靶转录本。（如图三所示）
Ago家族有不同的突变种和表型。研究发现，秀丽线虫有24个Ago蛋白，果蝇中有5个Ago蛋白，乳动物有8个同源蛋白Ago蛋白，所以RISC会呈现不同类型或者调控方式。根据Ago的不同，可以将RISC分为切割RISC与非切割RISC两类。对于一个特定的RISC是否切割一个mRNA分子，主要取决于以下几个方面：
目标mRNA的特性(主要包括分子结构及数量等)；
RISC的类型必须为切割RISC；
组织中，RISC的切割速度；
miRNA与靶基因必须满足一定的匹配程度；
miRNA的来源。
在人基因组中含有的8个AgO蛋白中，有4个成员存在于所有乳动物细胞中，在人类这类蛋白称为E1F2C/ hAgo；PIWI存在于精细胞和细胞中，RISC的其他组成分还包括人类免疫缺陷病毒活化反应RNA结合蛋( human immunodeficiency virus tran activating response RNA binding protein，TRBP)，干扰素诱导的蛋白激酶活化因子(wro rein activator of the interferon induced protein kinase，PACT)，运动神经元存活复合体( survival of motor neurons complex)，脆性X智障蛋白( fragile X mental retardation protin，FMRP)和 Tudor葡萄球菌核酸酶结构域包含蛋白( Tudor staphylococcal nuclease domain contining protein) 等。
(1)成熟的 miRNA与RISC结合。RISC含Dicr及其他蛋白质。RISC又称 miRNP，
和 miRNA结合的RISC称为“ miRISC"。
(2) Dicer 加工pre-miRNA与RNA双链解旋偶联，解旋的 miRNA只有一条单链保留在RISC中。
(3) argonaute(Ago)是RISC的核心成分，为 miRNA诱导的基因沉默所必需。Ago含有两个RNA结合域：PAZ，与成熟 MIRNA的3' 端结合；PIWI，类似核糖核酸酶-H，和引导链5'端结合。两者共同将成熟 miRNA定向，使其和靶mRNA互补。（如图四所示）
2、miRNA诱导的基因沉默模式及其相关机制
miRNA靶向互补 mRNAs导致目的mRNA切降解的过程被称为转录后基因沉默(ot ranscriptional gene silencing，PTGS)。有效的PTGS需要RISC对mRNA转录本的切割 。miRNA可以指导RISC在转录后水平下调基因的表达——mRNA的降解或翻译抑制。采取何种沉默方式是由mRNA的特性所决定的。如果mRNA能够与miRNA完全互补，该mRNA就会被RISC特异地降解；如果mRNA不能与 miRNA完全互补，仅在某个位点与 miRNA互补，那么RISC就不会特异地降解mRNA，只是阻止mRNA作为翻译的模板，使之不能合成蛋白质。在动物中，多数情况下复合物中的单链 miRNA与mRNA的 3' UTR不完全互补配对，从而阻碍对该mRNA的翻译，并以此来调控基因表达，但不影响mRNA的稳定性。如线虫中的 miRNA lin-4就是以这种方式调控它的两个靶基因——lin-14和lin-28的翻译。另一种主要的作用方式则与 siRNA诱导的转录后基因沉默的PTGS相类似，当 miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago2蛋白可通过对mRNA的切割直接导致其降解，完成基因沉默调控。
此外， miRNA诱导的基因沉默还存在一些其他的方式，如 miRNA还能通过组氨酸修饰和启动子区的DNA甲基化影响基因的表达；miRNA与 5' UTR相互作用然后上调基因表达，由胞浆转运入核，以及近些年来发现的 miRNA能加速mRNA脱腺苷酸化( accelerated deadenylation)而抑制基因表达等多种作用模式。
miRNA诱导基因沉默的机制可以归纳为以下两个主要方面:
(1) miRNA的翻译起始抑制与翻译起始后抑制
miRNA对翻译起始抑制的相关机制主要有如下一些观点：首先， miRNA可通过抑制核糖体的组装来阻断翻译起始，进而起到对翻译过程的抑制作用。miRNA的抑制作用需要靶mRNA具有m7G帽子结构成为支持这一理论的重要依据，由此可以推断 miRISC可能通过对翻译起始复合物形成抑制而发挥作用；Ago2中间结构域具有结合m7G帽子的活性，Ago2通过 对miRNA招募靶mRNA的 3' UTR，从而与起始复合物eIF4E/G竞争性结合m7G帽子，最终发挥对翻译起始复合物的抑制作用。还有一些观点认为，通过影响靶mRNA脱腺嘌呤反应，导致其 polyA尾缩短，从而使mRNA与 polyA结合蛋白( polya binding protein，PABP)受阻，进而影响蛋白质翻译的起始。
研究还表明，一些被 miRNA作用后的mRNA可以与多核糖体偶联，这些核糖体在翻译中处于非常活跃的状态。此外， miRNA的抑制作用还可能发生在翻译起始之后，这主要是由于其翻译过程的抑制作用是通过内部核糖体进入位点( internal ribosome entry site，IRES)什么是IRES，而不是依赖 MRNA m7G帽子来发挥作用。其他作用方式，比如对新生多肽链的翻译同步降解等目前还没有定论，有待进一步证实。
(2) miRNA介导的mRNA衰减(降解)
miRNA可诱导与其不完全配对的犯mRNA衰减(降解)。通过Ago蛋白定位于如P小体( processing bodies，P- bodies)等的RNA颗粒( RNA granules)中，这些颗粒中包含有mRNA降解的酶。这也可能是 miRNA介导mRNA衰减的一个重要途径。